Question

【題目】pUC18是基因工程中常用的質(zhì)粒運(yùn)載體，其結(jié)構(gòu)如圖1（其中HindⅢ、PstⅠ、EcoRⅠ等限制酶的識別位點(diǎn)之間的堿基對數(shù)忽略不計(jì)，lacZ是顯色基因）．

現(xiàn)將擴(kuò)增的含目的基因的外源DNA片段與pUC18質(zhì)粒都用PstI進(jìn)行酶切，然后用DNA連接酶進(jìn)行連接，構(gòu)建重組質(zhì)粒．為篩選非重組子和重組子，分別用不同的限制酶進(jìn)行酶切．經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果如圖1（1kb＝1000對堿基）．請據(jù)圖分析回答：

（1）與pUC18質(zhì)粒重組的目的基因大小為__kb．

（2）用kpnⅠ酶切pUC18質(zhì)粒，產(chǎn)生了1條2.7kb的帶；用kpnⅠ酶切重組質(zhì)粒，產(chǎn)生了2條帶，但有3.0kb+3.7kb或1.0kb+5.7kb兩組數(shù)據(jù)（圖2）．下列說法中合理的是_____

A．重組質(zhì)粒中有兩個kpnⅠ的酶切位點(diǎn)，且其中一個位于目的基因的區(qū)段

B．重組質(zhì)粒中有兩個kpnⅠ的酶切位點(diǎn)，都位于目的基因的區(qū)段

C．產(chǎn)生兩種酶切的結(jié)果，推測是目的基因與開環(huán)的pUC18拼接時有兩種可能的插入方向

D．產(chǎn)生兩種酶切的結(jié)果，推測是另有一種限制酶的酶切位點(diǎn)的堿基序列與kpnⅠ相同

（3）請?jiān)谀康幕�因上�?biāo)注kpnⅠ酶切位點(diǎn)___（需注明目的基因的堿基對數(shù)量及kpnⅠ酶切位點(diǎn)兩側(cè)的堿基對數(shù)量）

（4）大腸桿菌pUC18質(zhì)粒的LacZ基因中如果沒有插入外源基因，lacZ基因便可表達(dá)出β﹣半乳糖苷酶，當(dāng)培養(yǎng)基中含有IPTG和X﹣gal時，X﹣gal便會被β﹣半乳糖苷酶水解成藍(lán)色，大腸桿菌將形成藍(lán)色菌落．反之，則形成白色菌落．選擇培養(yǎng)基中除含有大腸桿菌必需的葡萄糖、氮源、無機(jī)鹽、水、生長因子等營養(yǎng)物質(zhì)外，還應(yīng)加_____、_____、_____入物質(zhì)．成功導(dǎo)入重組質(zhì)粒的大腸桿菌在培養(yǎng)基中形成_____顏色的菌落，原因是_____。

Answer 1

【答案】4 AC X﹣gal IPTG 氨芐青霉素 白色 lacZ基因被插入目的基因而失活

【解析】

1、分析題圖：用HindⅢ或EcoRⅠ切割后，pUC18質(zhì)粒只產(chǎn)生1條2.7kb的帶，重組子產(chǎn)生了2條帶，即4.0kb和2.7kb，非重組子產(chǎn)生1條帶，即2.7kb。用kpnⅠ酶切pUC18質(zhì)粒，產(chǎn)生了1條2.7kb的帶；用kpnⅠ酶切重組質(zhì)粒，產(chǎn)生了2條帶，但有3.0kb+3.7kb或1.0kb+5.7kb兩組數(shù)據(jù)，說明重組質(zhì)粒中有兩個kpnⅠ的酶切位點(diǎn)，且其中一個位于目的基因的區(qū)段，產(chǎn)生兩種酶切的結(jié)果的原因可能是目的基因與開環(huán)的pUC18拼接時有兩種可能的插入方向。

2、微生物培養(yǎng)基的成分有碳源、氮源、水、無機(jī)鹽和生長因子。

（1）根據(jù)圖1可知，pUC18質(zhì)粒的長度是2.7kb，而重組子的長度是2.7+4.0＝6.7kb，因此與pUC18質(zhì)粒重組的目的基因大小為4kb。

（2）AB、pUC18質(zhì)粒的長度是2.7kb，目的基因大小為4kb，用kpnⅠ酶切重組質(zhì)粒，產(chǎn)生了2條帶，但有3.0kb+3.7kb或1.0kb+5.7kb兩組數(shù)據(jù)，這說明重組質(zhì)粒中有兩個kpnⅠ的酶切位點(diǎn)，且其中一個位于目的基因的區(qū)段，A正確，B錯誤；

CD、產(chǎn)生兩種酶切的結(jié)果，推測是目的基因與開環(huán)的pUC18拼接時有兩種可能的插入方向，C正確，D錯誤。

故選：AC。

（3）用kpnⅠ酶切重組質(zhì)粒，產(chǎn)生了2條帶，但有3.0kb+3.7kb或1.0kb+5.7kb兩組數(shù)據(jù)，說明重組質(zhì)粒中有兩個kpnⅠ的酶切位點(diǎn)，且其中一個位于目的基因的區(qū)段，目的基因上標(biāo)注kpnⅠ酶切位點(diǎn)如圖：．

（4）大腸桿菌pUC18質(zhì)粒的LacZ基因中如果沒有插入外源基因，lacZ基因便可表達(dá)出β﹣半乳糖苷酶，當(dāng)培養(yǎng)基中含有IPTG和X﹣gal時，X﹣gal便會被β﹣半乳糖苷酶水解成藍(lán)色，大腸桿菌將形成藍(lán)色菌落。反之，則形成白色菌落。培養(yǎng)基中應(yīng)含有大腸桿菌必需的營養(yǎng)物質(zhì)包括碳源、氮源、無機(jī)鹽、水和生長因子。由于質(zhì)粒上含有氨芐青霉素抗性基因，因此導(dǎo)入質(zhì)粒的大腸桿菌能抗氨芐青霉素，所以培養(yǎng)基中還應(yīng)加入氨芐青霉素，作用是篩選出導(dǎo)入pUC18質(zhì)粒的大腸桿菌，此外培養(yǎng)基中還應(yīng)加入IPTG、X﹣gal。重組質(zhì)粒上的LacZ基因被破壞，不能產(chǎn)生β一半乳糖苷酶，若大腸桿菌中已成功導(dǎo)入了重組質(zhì)粒，則其在含有IPTG和X﹣gal的培養(yǎng)基中形成白色菌落。