Question

【題目】科研人員利用大腸桿菌構(gòu)建了抗蟲基因文庫。最新研究發(fā)現(xiàn)漏斗蜘蛛中的AH基因控制合成的毒素肽具有顯著的殺蟲效果，現(xiàn)以p-B質(zhì)粒為載體，構(gòu)建AH基因的cDNA文庫。圖1表示p-B質(zhì)粒，其中Cm!r表示氯霉素抗性基因，ccdB 基因表達(dá)產(chǎn)物能抑制大腸桿菌DNA復(fù)制。圖中箭頭表示相關(guān)限制酶的酶切位點(diǎn)，且不同種限制酶識(shí)別序列不同，其中Aiu I、Xba I、Ssp I和Mfe I識(shí)別的堿基序列和酶切位點(diǎn)分別是AGLCT、T4CTAGA、AATIATT、 CIAATTG。請(qǐng)分析回答：

（1）為獲得AH基因的cDNA，先要從漏斗蜘蛛毒素肽分泌細(xì)胞中提取_________， 再利用反應(yīng)體系中添加__________， 從而準(zhǔn)確合成出AH基因的cDNA，排除其他提取物的干擾。若從漏斗蜘蛛其他組織細(xì)胞提取，則難以成功，原因是其他組織細(xì)胞中_________。

（2）利用圖中的質(zhì)粒和AH基因構(gòu)建重組質(zhì)粒時(shí)，宜選用________雙酶切質(zhì)粒， 再選用_________切割目 的基因，將切割后獲得的DNA片段混合，經(jīng)DNA連接酶處理后，再與大腸桿菌混合培養(yǎng)，在含有適量氯霉素的培養(yǎng)基中添加適量冷凍的________，以促進(jìn)轉(zhuǎn)化。

（3）經(jīng)上述處理培養(yǎng)后，獲得存活的大腸桿菌中應(yīng)含有的質(zhì)粒是________，原因是_________。

Answer 1

【答案】RNA 特異性引物 AH基因不表達(dá) Aiu和MfeI SspI和MfeI CaCl2（或Ca2+） 重組質(zhì)粒 重組質(zhì)粒中的ccdB基因被破壞，不能抑制DNA復(fù)制

【解析】

基因工程技術(shù)的基本步驟：

（1）目的基因的獲�。悍椒ㄓ袕幕�因文庫中獲取、利用PCR技術(shù)擴(kuò)增和人工合成。

（2）基因表達(dá)載體的構(gòu)建：是基因工程的核心步驟，基因表達(dá)載體包括目的基因、啟動(dòng)子、終止子和標(biāo)記基因等。

（3）將目的基因?qū)�入受體細(xì)胞：根據(jù)受體細(xì)胞不同，導(dǎo)入的方法也不一樣．將目的基因?qū)�入植物�?xì)胞的方法有農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法、基因槍法和花粉管通道法；將目的基因?qū)�入�?dòng)物細(xì)胞最有效的方法是顯微注射法；將目的基因?qū)�入微生物�?xì)胞的方法是感受態(tài)細(xì)胞法。

（4）目的基因的檢測(cè)與鑒定：

分子水平上的檢測(cè)：

①檢測(cè)轉(zhuǎn)基因生物染色體的DNA是否插入目的基因--DNA分子雜交技術(shù)；

②檢測(cè)目的基因是否轉(zhuǎn)錄出了mRNA--分子雜交技術(shù)；

③檢測(cè)目的基因是否翻譯成蛋白質(zhì)--抗原-抗體雜交技術(shù)。

個(gè)體水平上的鑒定：抗蟲鑒定、抗病鑒定、活性鑒定等。

（1）cDNA是以RNA為模板逆轉(zhuǎn)錄而成的，因此為獲得AH基因的cDNA，先要從漏斗蜘蛛毒素肽分泌細(xì)胞中提取RNA，再利用反應(yīng)體系中添加的特異性引物，從而準(zhǔn)確合成出AH基因的cDNA，排除其他提取物的干擾。若從漏斗蜘蛛其他組織細(xì)胞提取，則難以成功，原因是存在基因的選擇性表達(dá)，其他組織細(xì)胞中AH基因不表達(dá)。

（2）質(zhì)粒中含有多種限制酶識(shí)別序列，但用限制酶XbaI切割會(huì)破壞復(fù)制原點(diǎn)，因此不能用該酶切割；由于ccdB基因表達(dá)產(chǎn)物能抑制大腸桿菌DNA復(fù)制，因此構(gòu)建基因表達(dá)載體時(shí)，應(yīng)該破壞該基因，即需要用限制酶MfeI切割；若用Sph I和MfeI切割會(huì)導(dǎo)致啟動(dòng)子丟失，因此不能用限制酶SphI切割；若用MfeI和SacI切割則不能獲取目的基因AH。綜合以上可知，利用圖中的質(zhì)粒和AH基因構(gòu)建重組質(zhì)粒時(shí)，宜選用AiuI（產(chǎn)生平末端）和Mfel雙酶切質(zhì)粒，再選用Sspl（產(chǎn)生平末端）和Mfel切割目的基因。將切割后獲得的DNA片段混合，經(jīng)DNA連接酶處理后，再與大腸桿菌混合培養(yǎng)，在含有適量氯霉素的培養(yǎng)基中添加適量冷凍的CaCl2（或Ca2+），使受體細(xì)胞成為易于吸收周圍環(huán)境中DNA分子的感受態(tài)細(xì)胞，以促進(jìn)轉(zhuǎn)化。

（3）由于重組質(zhì)粒中的ccdB基因被破壞，不能抑制DNA復(fù)制，因此獲得的存活的大腸桿菌中應(yīng)含有的質(zhì)粒是重組質(zhì)粒。