Question

【題目】hNaDC3（人鈉/二羧酸協(xié)同轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白-3）主要分布于腎臟等重要器官，它具有促進(jìn)人腎小管上皮細(xì)胞能量代謝和轉(zhuǎn)運(yùn)等功能�？蒲腥藛T利用基因工程技術(shù)構(gòu)建綠色熒光蛋白與hNaDC3融合基因，并在腎小管上皮細(xì)胞中表達(dá)，以動態(tài)觀察hNaDC3在腎小管上皮細(xì)胞中的定位情況，為進(jìn)一步研究hNaDC3的生理功能奠定基礎(chǔ)。研究主要過程如圖（實(shí)驗(yàn)中使用的限制酶SacⅠ的識別序列是GAGCT↓C，限制酶SacⅡ識別序列是CCGC↓GG）。請分析回答：

（1）與PCR相比，過程①需要的特有的酶是_______，應(yīng)從人體__________（器官）的組織細(xì)胞中獲得模板RNA。

（2）DNA分子被SacⅠ切割后，形成的黏性末端是______。過程②選用SacⅠ、SacⅡ分別切割hNaDC3基因和質(zhì)粒載體，可實(shí)現(xiàn)目的基因定向插入并正常表達(dá)的原因是_________。

（3）過程③可獲得多種重組DNA，可依據(jù)不同DNA分子的大小，運(yùn)用________（技術(shù)）分離、篩選重組表達(dá)載體。過程④將重組表達(dá)載體導(dǎo)入豬腎小管上皮細(xì)胞最常用的方法是____________。

（4）顯微觀察導(dǎo)入“綠色熒光蛋白-hNaDC3融合基因”的豬腎小管上皮細(xì)胞后發(fā)現(xiàn)：轉(zhuǎn)染后第1天綠色熒光混合分布于細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞膜，核中未見綠色熒光；到第5天綠色熒光清晰聚集于細(xì)胞膜，細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核中未見綠色熒光。根據(jù)這一觀察結(jié)果還不能得出“hNaDC3是在細(xì)胞質(zhì)中生成后，在細(xì)胞膜上發(fā)揮作用”的結(jié)論，需要設(shè)置對照實(shí)驗(yàn)以排除綠色熒光蛋白本身的定位，對照實(shí)驗(yàn)的設(shè)計(jì)思路是___________。

（5）研究人員以較高濃度的葡萄糖溶液培養(yǎng)導(dǎo)入融合基因的豬腎小管上皮細(xì)胞，一段時(shí)間后發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)染細(xì)胞的細(xì)胞膜上綠色熒光明顯增強(qiáng)。這一實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以說明______。

Answer 1

【答案】逆轉(zhuǎn)錄酶 腎臟 —AGCT 兩種限制酶切割產(chǎn)生的黏性末端不同 （凝膠）電泳 顯微注射法 將GFP基因表達(dá)載體直接導(dǎo)入豬腎小管上皮細(xì)胞，然后觀察綠色熒光在細(xì)胞中的分布情況 較高濃度葡萄糖能增強(qiáng)腎小管上皮細(xì)胞中hNaDC3基因的表達(dá)

【解析】

對題圖進(jìn)行分析可知，過程①以RNA為模板，通過反轉(zhuǎn)錄作用合成目的基因；過程②表示構(gòu)建hNaDC3基因表達(dá)載體；過程③表示構(gòu)建綠色熒光蛋白-hNaDC3融合基因的表達(dá)載體；④表示將目的基因?qū)�入受體細(xì)胞；⑤表示目的基因的檢測和鑒定。

（1）過程①以RNA為模板，通過反轉(zhuǎn)錄作用合成目的基因。與PCR相比，過程①需要的特有的酶是逆轉(zhuǎn)錄酶。由于基因的選擇性表達(dá)，所以只能從人體腎臟的組織細(xì)胞中獲得模板RNA。

（2）根據(jù)題意可知，“限制酶SacⅠ的識別序列是GAGCT↓C”，因此DNA分子被SacⅠ切割后，形成的黏性末端是—AGCT。過程②選用SacⅠ、SacⅡ分別切割hNaDC3基因和質(zhì)粒載體，兩種限制酶切割產(chǎn)生的黏性末端不同，因此可實(shí)現(xiàn)目的基因定向插入并正常表達(dá)。

（3）過程③可獲得多種重組DNA，可依據(jù)不同DNA分子的大小，運(yùn)用（凝膠）電泳分離、篩選重組表達(dá)載體。將重組表達(dá)載體導(dǎo)入動物細(xì)胞最常用的方法是顯微注射法。

（4）根據(jù)題意可知，實(shí)驗(yàn)探究目的為“hNaDC3是在細(xì)胞質(zhì)中生成后，在細(xì)胞膜上發(fā)揮作用”。需要設(shè)置對照實(shí)驗(yàn)排除綠色熒光蛋白本身的定位，即將GFP基因表達(dá)載體直接導(dǎo)入豬腎小管上皮細(xì)胞，然后觀察綠色熒光在細(xì)胞中的分布情況。

（5）用較高濃度的葡萄糖溶液培養(yǎng)導(dǎo)入融合基因的豬腎小管上皮細(xì)胞，一段時(shí)間后發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)染細(xì)胞的細(xì)胞膜上綠色熒光明顯增強(qiáng)，說明較高濃度葡萄糖能增強(qiáng)腎小管上皮細(xì)胞中hNaDC3基因的表達(dá)。