Question

【題目】斑馬魚的HuC基因在早期胚胎神經(jīng)細(xì)胞中選擇性表達(dá)，研究人員構(gòu)建了HuC基因的表達(dá)載體，并導(dǎo)入到斑馬魚細(xì)胞中研究其作用，請(qǐng)回答：

（1）為獲取HuC基因，研究人員從早期胚胎神經(jīng)細(xì)胞中提取HuC基因的mRNA，通過_________獲得大量的DNA，進(jìn)而構(gòu)建出HuC基因的______________。

（2）DraⅢ， SnaBⅠ等是質(zhì)粒上不同限制酶的切割位點(diǎn)。為獲得HuC基因——綠色熒光蛋白基因的表達(dá)載體，需要對(duì)HuC基因和質(zhì)粒選用圖中的____________酶進(jìn)行切割，這樣做的原因是_________。不選擇NotⅠ酶切割的原因是_____________。

（3）用Ca2+處理大腸桿菌，大腸桿菌細(xì)胞即能夠______________。實(shí)驗(yàn)過程中可以采用在熒光顯微鏡下觀察________________________或者在培養(yǎng)基中添加______________，篩選出導(dǎo)入表達(dá)載體的大腸桿菌。

Answer 1

【答案】逆轉(zhuǎn)錄和PCR技術(shù)擴(kuò)增 cDNA文庫 EcoRⅠ酶和BamHⅠ 可以防止目的基因和質(zhì)粒自身環(huán)化以及目的基因與質(zhì)粒反向連接 破壞標(biāo)記基因無法篩選（且沒有啟動(dòng)子） 吸收周圍環(huán)境中的DNA分子 表達(dá)的綠色熒光蛋白菌落 卡那霉素

【解析】

基因工程技術(shù)的基本步驟：

（1）目的基因的獲取：方法有從基因文庫中獲取、利用PCR技術(shù)擴(kuò)增和人工合成。

（2）基因表達(dá)載體的構(gòu)建：是基因工程的核心步驟，基因表達(dá)載體包括目的基因、啟動(dòng)子、終止子和標(biāo)記基因等。

（3）將目的基因?qū)�入受體細(xì)胞：根據(jù)受體細(xì)胞不同，導(dǎo)入的方法也不一樣。將目的基因?qū)�入植物�?xì)胞的方法有農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法、基因槍法和花粉管通道法；將目的基因?qū)�入�?dòng)物細(xì)胞最有效的方法是顯微注射法；將目的基因?qū)�入微生物�?xì)胞的方法是感受態(tài)細(xì)胞法。

（4）目的基因的檢測(cè)與鑒定：分子水平上的檢測(cè)：①檢測(cè)轉(zhuǎn)基因生物染色體的DNA是否插入目的基因—DNA分子雜交技術(shù)；②檢測(cè)目的基因是否轉(zhuǎn)錄出了mRNA—分子雜交技術(shù)；③檢測(cè)目的基因是否翻譯成蛋白質(zhì)—抗原-抗體雜交技術(shù)。個(gè)體水平上的鑒定：抗蟲鑒定、抗病鑒定、活性鑒定等。

（1）從早期胚胎神經(jīng)細(xì)胞中提取HuC基因的mRNA，通過逆轉(zhuǎn)錄過程合成目的基因，并通過PCR技術(shù)在體外擴(kuò)增可獲得大量的目的基因，進(jìn)而構(gòu)建出HuC基因的cDNA文庫。

（2）構(gòu)建基因表達(dá)載體時(shí)，不能破壞運(yùn)載體上的啟動(dòng)子、復(fù)制原點(diǎn)，以及運(yùn)載體上需要保留標(biāo)記基因，為了防止目的基因和質(zhì)粒自身環(huán)化以及目的基因與質(zhì)粒反向連接，常用不同的限制酶切割質(zhì)粒和目的基因，結(jié)合圖示中各種限制酶的酶切位點(diǎn)可知，為獲得HuC基因——綠色熒光蛋白基因的表達(dá)載體，需要對(duì)HuC基因和質(zhì)粒選用圖中的EcoRⅠ酶和BamHⅠ酶進(jìn)行切割�？�那霉素抗性基因?yàn)闃?biāo)記基因，若用NotⅠ酶切割，將會(huì)導(dǎo)致卡那霉素抗性基因被破壞，且切割后的質(zhì)粒會(huì)失去啟動(dòng)子，使基因表達(dá)載體中缺少標(biāo)記基因無法選擇，且沒有啟動(dòng)子無法轉(zhuǎn)錄，所以不選擇NotⅠ酶切割質(zhì)粒。

（3）用Ca2+處理大腸桿菌使之成為感受態(tài)細(xì)胞，易于吸收周圍環(huán)境中的DNA分子。由于綠色熒光蛋白表達(dá)后會(huì)發(fā)綠光，所以實(shí)驗(yàn)過程中可以采用在熒光顯微鏡下觀察表達(dá)的綠色熒光蛋白菌落或者在培養(yǎng)基中添加卡那霉素，篩選出導(dǎo)入表達(dá)載體的大腸桿菌。