Question

【題目】許多大腸桿菌的質(zhì)粒上含有l(wèi)acZ′基因（內(nèi)含EcoRI的酶切位點(diǎn)），其編碼的產(chǎn)物β-半乳糖苷酶在X-gal 和IPTG存在下，可以產(chǎn)生藍(lán)色沉淀，使菌落呈現(xiàn)藍(lán)色，否則菌落呈現(xiàn)白色。基因工程中常利用該原理從導(dǎo)入質(zhì)粒的受體細(xì)胞中篩選出真正導(dǎo)入重組質(zhì)粒的細(xì)胞，過(guò)程如圖所示。請(qǐng)據(jù)圖回答：

（1）限制酶EcoRⅠ的識(shí)別序列和酶切位點(diǎn)是-G↓AATTC-，SmaⅠ的識(shí)別序列和酶切位點(diǎn)是-CCC↓GGG-。圖中目的基因被切割下來(lái)和質(zhì)粒連接之前，需在目的基因的右側(cè)連接相應(yīng)的末端，連接的末端序列是_____________。

（2）轉(zhuǎn)化過(guò)程中，大腸桿菌應(yīng)先用_____________處理，使其成為 細(xì)胞。

（3）菌落①②③中顏色為白色的是__________，原因是________________________________。

（4）菌落③中的目的基因是否表達(dá)，可采用的檢測(cè)辦法是_____________。

Answer 1

【答案】

（1）-TTAA

（2）Ca2+ 感受態(tài)細(xì)胞

（3）菌落③ lacZ′標(biāo)記基因區(qū)插入外源基因后被破壞，不能表達(dá)出β半乳糖苷酶，故菌落為白色

（4）抗原—抗體雜交

【解析】

試題

（1）由圖可知，目的基因的左側(cè)有限制酶EcoRI的識(shí)別序列，右側(cè)是限制酶Sma I的識(shí)別序列，而質(zhì)粒上只有限制酶EcoRI的識(shí)別序列，所以需要用限制酶EcoRI來(lái)切割質(zhì)粒，用限制酶EcoRI和Sma I來(lái)切割含有目的基因的外源DNA分子，這樣就使目的基因右側(cè)無(wú)法與質(zhì)粒連接，所以目的基因被切割下來(lái)和質(zhì)粒連接之前，需在目的基因的右側(cè)連接限制酶EcoRI切割形成的末端，即-TTAA，連接過(guò)程中需要DNA連接酶。

（2）將目的基因?qū)�入大腸桿菌細(xì)胞之前，應(yīng)先用Ca2＋處理大腸桿菌，使其處于能吸收周圍DNA的感受態(tài)。

（3）用限制酶EcoRI切割質(zhì)粒時(shí)，會(huì)破壞質(zhì)粒上的lacZ'基因，但切割后的質(zhì)粒自身環(huán)化后，lacZ'基因又被修復(fù)，能表達(dá)產(chǎn)生B-半乳糖苷酶，在X-gal和IPTG存在下，可以產(chǎn)生藍(lán)色沉淀，使菌落呈現(xiàn)藍(lán)色，所以菌落①②呈現(xiàn)藍(lán)色；菌落③導(dǎo)入的是重組質(zhì)粒，其lacZ'基因被破壞，不能表達(dá)產(chǎn)生B-半乳糖苷酶，在X-gal和IPTG存在下，菌落顏色為白色。

（4）檢測(cè)目的基因是否表達(dá)產(chǎn)生蛋白質(zhì)，可采用抗原－抗體雜交法。