Question

【題目】人體內(nèi)的t-PA蛋白能高效降解由纖維蛋白凝聚而成的血栓，是心梗和腦血栓的急救藥。然而，為心�；颊咦⑸浯髣┝康幕�因工程t- PA會誘發(fā)顱內(nèi)出血，其原因在于t-PA與纖維蛋白結(jié)合的特異性不高。研究證實，將t-PA第84位的半胱氨酸換成絲氨酸，能顯著降低出血副作用。據(jù)此，先對天然的t-PA基因進行序列改造，然后再采取傳統(tǒng)的基因工程方法表達該改造后的基因，可制造出性能優(yōu)異的改良t-PA蛋白。(注：下圖表示相關(guān)的目的基因、載體及限制酶。pCLY11為質(zhì)粒，新霉素為抗生素。)

請回答下列問題：

（1）以上制造出性能優(yōu)異的改良t-PA蛋白的過程被稱為____________工程。

（2）已知人t-PA基因序列已測出，且第84位半胱氨酸的模板鏈堿基序列為ACA，而絲氨酸的模板鏈堿基序列為AGA，因此要獲得改造后的目的基因最好采用 _____________法獲得。

（3）若t-PA改良基因的黏性末端如圖所示，那么需選用限制酶XmaI和 _________切開質(zhì)粒pCLY11，才能與t PA改良基因高效連接。在基因工程中，最核心的一步為_______________________。

（4）一般選擇在未加入新霉素的培養(yǎng)基中生存的大腸桿菌作為受體細胞，目的是_____。在加入新霉索的培養(yǎng)基中形成菌落的受體細胞并非都是目的菌株，原因是_____________，這時需選擇呈_____________色的菌落，進步培養(yǎng) 、檢測和鑒定，以選育出能生產(chǎn)改良t-PA蛋白的工程菌株。

Answer 1

【答案】蛋白質(zhì) 化學(xué)合成 BglⅡ 基因表達載體的構(gòu)建 以便篩選出導(dǎo)入質(zhì)粒pCLY11的大腸桿菌 導(dǎo)入未連目的基因的質(zhì)粒的大腸桿菌也可以在這種培養(yǎng)基上生長 白

【解析】

蛋白質(zhì)工程是指根據(jù)人們對蛋白質(zhì)功能的特定需求，對蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)進行分子設(shè)計。目的基因的獲取可以從基因文庫中提取，可以使用PCR進行擴增獲得。對于基因比較小，核苷酸序列已知，也可以直接使用DNA合成儀用化學(xué)方法直接人工合成。

（1）在原有的t-PA蛋白基礎(chǔ)上改良蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)，屬于蛋白質(zhì)工程；

（2）由于t-PA蛋白基因的序列已知，因此可以使用化學(xué)合成的方法獲得目的基因；

（3）目的基因的黏性末端圖中已經(jīng)給出，觀察各限制酶的識別序列可知所使用的限制酶為XmaI和BglⅡ，要想把目的基因與運載體拼接起來需要得到相同的黏性末端，因此運載體也需要XmaI和BglⅡ切割；基因工程中最核心的一個環(huán)節(jié)為基因表達載體的構(gòu)建；

（4）選擇未加入新霉素的培養(yǎng)基中生存的大腸桿菌作為受體細胞，這些細胞沒有新霉素的抗性，當其導(dǎo)入重組質(zhì)粒后，質(zhì)粒上的標記基因使得大腸桿菌具有新霉素抗性，這樣可以選擇導(dǎo)入質(zhì)粒pCLY11的大腸桿菌；由于標記基因存在于原有質(zhì)粒上，若未連目的基因的質(zhì)粒導(dǎo)入到大腸桿菌中，這些大腸桿菌也可以獲得新霉素的抗性；而區(qū)分重組質(zhì)粒和原有質(zhì)粒的一個標志可以觀察mlacZ基因的表達情況，由于重組質(zhì)粒拼接了目的基因，破壞了mlacZ基因，因此在重組質(zhì)粒中該基因不表達，菌落呈現(xiàn)白色，而原有基因由于該基因保存完整，可以表達，所以菌落呈現(xiàn)藍色。