Question

【題目】口蹄疫是由口蹄疫病毒引起的一種動物傳染病,目前常用接種弱毒疫苗的方法預(yù)防。疫苗的主要成分是該病毒的一種結(jié)構(gòu)蛋白VP1�？茖W(xué)家嘗試?yán)�用轉(zhuǎn)基因番茄來生產(chǎn)口蹄疫疫苗。請回答下列問題:

（1）如圖是VP1基因、農(nóng)桿菌Ti質(zhì)粒結(jié)構(gòu)示意圖,若用以構(gòu)建具有VP1基因的基因表達(dá)載體,還需要在質(zhì)粒中插入______，該結(jié)構(gòu)的作用是______。

（2）口蹄疫病毒的遺傳物質(zhì)為RNA,則獲得可重組到質(zhì)粒的VP1基因必須用到______酶。要獲得大量VP1基因,可利用PCR技術(shù)進(jìn)行擴(kuò)增，擴(kuò)增時需要設(shè)計(jì)______種引物。PCR技術(shù)中所用的DNA聚合酶與生物體內(nèi)的DNA聚合酶有何區(qū)別______。

（3）通常用BamHⅠ、HindⅢ兩種限制酶切割VP1基因和Ti質(zhì)粒的目的是______;要篩選出含有該目的基因表達(dá)載體的農(nóng)桿菌,首先需要在含______的培養(yǎng)基上進(jìn)行。

（4）VP1基因應(yīng)插入到農(nóng)桿菌Ti質(zhì)粒的T-DNA上,通過轉(zhuǎn)化作用進(jìn)入番茄細(xì)胞并插入到______,使VP1基因能夠穩(wěn)定存在并發(fā)揮作用。

（5）獲得表達(dá)VP1蛋白的番茄植株以后,要進(jìn)行免疫效力的測定,具體方法是:將從轉(zhuǎn)基因番茄葉片中提取的VP1蛋白注射到一定數(shù)量的豚鼠體內(nèi),每半個月注射一次,三次注射后檢測豚鼠血液中產(chǎn)生的______數(shù)量,為了使結(jié)果可信,應(yīng)設(shè)置空白對照組,注射______。

Answer 1

【答案】啟動子 RNA聚合酶識別、結(jié)合的部位，驅(qū)動基因轉(zhuǎn)錄 逆轉(zhuǎn)錄 2 耐高溫 防止VP1基因、Ti質(zhì)粒的自身環(huán)化(和任意連接) 卡那霉素 染色體DNA VP1蛋白的抗體 等量生理鹽水

【解析】

基因工程技術(shù)的基本步驟：

（1）目的基因的獲�。悍椒ㄓ袕幕�因文庫中獲取、利用PCR技術(shù)擴(kuò)增和人工合成。

（2）基因表達(dá)載體的構(gòu)建：是基因工程的核心步驟，基因表達(dá)載體包括目的基因、啟動子、終止子和標(biāo)記基因等。

（3）將目的基因?qū)�入受體細(xì)胞：根據(jù)受體細(xì)胞不同，導(dǎo)入的方法也不一樣。將目的基因?qū)�入植物�?xì)胞的方法有農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法、基因槍法和花粉管通道法；將目的基因?qū)�入動物�?xì)胞最有效的方法是顯微注射法；將目的基因?qū)�入微生物�?xì)胞的方法是感受態(tài)細(xì)胞法。

（4）目的基因的檢測與鑒定：分子水平上的檢測：①檢測轉(zhuǎn)基因生物染色體的DNA是否插入目的基因--DNA分子雜交技術(shù)；②檢測目的基因是否轉(zhuǎn)錄出了mRNA--分子雜交技術(shù)；③檢測目的基因是否翻譯成蛋白質(zhì)--抗原-抗體雜交技術(shù)。個體水平上的鑒定：抗蟲鑒定、抗病鑒定、活性鑒定等。

（1）構(gòu)建具有VP1基因的基因表達(dá)載體還需要在質(zhì)粒中插入啟動子，啟動子是RNA聚合酶的識別、結(jié)合位點(diǎn)，能啟動轉(zhuǎn)錄過程。

（2）口蹄疫病毒的遺傳物質(zhì)為RNA，可以RNA為模板逆轉(zhuǎn)錄獲得VPI基因；PCR技術(shù)可在體外大量擴(kuò)增目的基因，該過程中需要設(shè)計(jì)2種引物分別與模板鏈結(jié)合，PCR擴(kuò)增過程中需要耐高溫的DNA聚合酶催化子鏈的延伸。

（3）用BamH I、HindIII兩種限制酶切割出的末端完全不同，這樣可以防止目的基因、運(yùn)載體自身環(huán)化，也能防止目的基因和運(yùn)載體反向連接，即可以保證目的基因和質(zhì)粒的定向連接。由圖可知，標(biāo)記基因是卡那霉素抗性基因，因此要篩選出含有該目的基因表達(dá)載體的番茄細(xì)胞，首先需要在含卡那霉素的培養(yǎng)基上進(jìn)行。

（4）VP1基因應(yīng)插入到農(nóng)桿菌Ti質(zhì)粒的T-DNA上，通過轉(zhuǎn)化作用進(jìn)入番茄細(xì)胞并插入到染色體DNA，使VP1基因能夠穩(wěn)定維持并發(fā)揮作用。

（5）獲得表達(dá)VP1蛋白的番茄植株以后，要進(jìn)行免疫效力的測定，具體方法是：將從轉(zhuǎn)基因番茄葉片中提取的VP1蛋白質(zhì)注射到一定數(shù)量的豚鼠體內(nèi)，每半個月注射一次，三次注射后檢測豚鼠血液中產(chǎn)生的VP1蛋白的抗體數(shù)量，為了使結(jié)果可信，應(yīng)設(shè)置空白對照組，注射VP1蛋白的抗體等量生理鹽水。