Question

【題目】為研究肝癌致病機理，科研工作者利用下圖所示的差異雜交法和基因工程獲取相關(guān)癌基因以作進一步研究。請據(jù)圖回答問題：

（1）圖 1 中，A 過程需要用___________ 酶，D 過程需要回收___________ （填“未雜交”或“雜交分子”）的含 32P 的 cDNA 單鏈，繼而通過人工合成，獲得___________， 并用其構(gòu)建基因文庫。

（2）分子生物學檢測是基因工程成功與否的重要一環(huán)，其中檢測目的基因是否發(fā)揮功能作用的第一 步是檢測_________________________ ，若檢測目的基因是否成功表達，則需用_______________ 方 法，該方法的原理是_____________________。

（3）上圖 2 為改造后的目的基因。圖 3 為兩種質(zhì)粒，其中 Ampr 為氨芐青霉素抗性基因，Tetr 為四環(huán)素抗性基因，lacZ 為藍色顯色基因，其表達產(chǎn)物可使底物 X-Gal 呈藍色。EcoRⅠ（0.7Kb）、NotⅠ（1.2Kb）等為限制酶及其切割位點與復制原點之間的距離（1kb=1000 個堿基對）。

①圖 3 中能作為載體的最理想的質(zhì)粒是___________（填“X”或“Y”），用選定的質(zhì)粒與圖 2 的目的基因構(gòu)建基因表達載體時，應(yīng)選用的限制酶是___________。

②若用 EcoRⅠ完全酶切上述①中獲得的重組質(zhì)粒，并進行電泳觀察，可出現(xiàn)四種長度不同的片段，其長度分別為 1.7kb、5.3kb、______________________。

Answer 1

【答案】逆轉(zhuǎn)錄酶 未雜交 雙鏈cDNA 目的基因是否轉(zhuǎn)錄出mRNA 抗原-抗體雜交 抗原與抗體的特異性結(jié)合 X NotⅠ 3.1kb和3.9kb

【解析】

1、基因工程技術(shù)的基本步驟：

（1）目的基因的獲�。悍椒ㄓ袕幕�因文庫中獲取、利用PCR技術(shù)擴增和人工合成。

（2）基因表達載體的構(gòu)建：是基因工程的核心步驟，基因表達載體包括目的基因、啟動子、終止子和標記基因等。

（3）將目的基因?qū)�入受體細胞：根據(jù)受體細胞不同，導入的方法也不一樣．將目的基因?qū)�入植物細胞的方法有農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法、基因槍法和花粉管通道法；將目的基因?qū)�入動物細胞最有效的方法是顯微注射法；將目的基因?qū)�入微生物細胞的方法是感受態(tài)細胞法。

（4）目的基因的檢測與鑒定：分子水平上的檢測：①檢測轉(zhuǎn)基因生物染色體的DNA是否插入目的基因--DNA分子雜交技術(shù)；②檢測目的基因是否轉(zhuǎn)錄出了mRNA--分子雜交技術(shù)；③檢測目的基因是否翻譯成蛋白質(zhì)--抗原-抗體雜交技術(shù)。個體水平上的鑒定：抗蟲鑒定、抗病鑒定、活性鑒定等。

（1）據(jù)圖可知圖1為構(gòu)建基因文庫的過程，其中需要單鏈mRNA通過A過程形成雜交雙鏈分子，需要逆轉(zhuǎn)錄酶，D過程需要回收未雜交的含 32P 的 cDNA 單鏈，繼而通過人工合成，獲得雙鏈cDNA，并用其構(gòu)建基因文庫。

（2）其中檢測目的基因是否發(fā)揮功能作用的第一步是檢測目的基因是否轉(zhuǎn)錄出mRNA ，若檢測目的基因是否成功表達（是否合成相關(guān)蛋白質(zhì)），則需用抗原-抗體雜交方法，該方法的原理是抗原與抗體的特異性結(jié)合。

（3）質(zhì)粒X既有四環(huán)素抗性基因Tetr ，藍色顯色基因lacZ ，便于對目的基因進行監(jiān)測和篩選。因此能做為載體的最理想的質(zhì)粒是X，NotⅠ的切割位點位于目的基因兩側(cè)，不會破壞目的基因，而EcoRⅠ的切割位點位于基因中間，會破壞目的基因，因此用選定的質(zhì)粒與圖 2 的目的基因構(gòu)建基因表達載體時，應(yīng)選用的限制酶是NotⅠ。若用 EcoRⅠ完全酶切上述①中獲得的重組質(zhì)粒，并進行電泳觀察，可出現(xiàn)四種長度不同的片段，分析重組質(zhì)粒，合并重復長度可知其長度分別為 1.7kb、5.3kb、3.1kb和3.9kb。