Question

【題目】下表中列出了幾種限制酶識(shí)別序列及其切割位點(diǎn)，圖l、圖2中箭頭表示相關(guān)限制酶的酶切位點(diǎn)。請(qǐng)回答下列問題：

（1）一個(gè)圖1所示的質(zhì)粒分子經(jīng)SmaⅠ切割前、后，分別含有 、 個(gè)游離的磷酸基團(tuán)。

（2）若對(duì)圖中質(zhì)粒進(jìn)行改造，插入的SmaⅠ酶切位點(diǎn)越多，質(zhì)粒的熱穩(wěn)定性越 。

（3）用圖中的質(zhì)粒和外源DNA構(gòu)建重組質(zhì)粒，不能使用SmaⅠ切割，原因是 。

（4）與只使用EcoR I相比較，使用BamHⅠ和Hind Ⅲ兩種限制酶同時(shí)處理質(zhì)粒、外源DNA的優(yōu)點(diǎn)在于可以防止 。

（5）為了獲取重組質(zhì)粒，將切割后的質(zhì)粒與目的基因片段混合，并加入 酶，若兩兩相連，則連接產(chǎn)物中有哪幾種情況? 。

（6）重組質(zhì)粒中抗生素抗性基因的作用是為了 。

（7）為了從cDNA文庫(kù)中分離獲取蔗糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因，將重組質(zhì)粒導(dǎo)入喪失吸收蔗糖能力的大腸桿菌突變體，然后在 的培養(yǎng)基中培養(yǎng)，以完成目的基因表達(dá)的初步檢測(cè)。

Answer 1

【答案】

（1）0、2

（2）高

（3）SmaⅠ破壞質(zhì)粒上的抗性基因和外源DNA中的目的基因

（4）質(zhì)粒和含目的基因的外源DNA片段自身環(huán)化

（5）DNA連接 目的基因自身相連的、運(yùn)載體自身相連的和目的基因與運(yùn)載體相連（3分）

（6）（鑒別和）篩選含有目的基因的受體細(xì)胞

（7）蔗糖為唯一含碳營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)

【解析】

試題分析：

（1）雙鏈DNA中兩條脫氧核苷酸鏈中各有一個(gè)游離的磷酸基，而質(zhì)粒呈環(huán)狀，沒有游離磷酸基；質(zhì)粒上有一個(gè)Sma Ⅰ切點(diǎn)，經(jīng)該酶處理后的質(zhì)粒呈鏈狀，出現(xiàn)兩個(gè)游離磷酸基。

（2）根據(jù)SmaⅠ識(shí)別的核苷酸序列中都為C-G堿基對(duì)，由于每個(gè)C-G堿基對(duì)之間能形成3個(gè)氫鍵，每個(gè)A-T堿基對(duì)之間能形成2個(gè)氫鍵，因此，DNA分子中C-G堿基對(duì)比例越高，DNA分子越穩(wěn)定。

（3）用SmaⅠ酶切割外源DNA和質(zhì)粒時(shí)，會(huì)導(dǎo)致目的基因與抗性基因被破壞，因此不能用SmaⅠ構(gòu)建重組質(zhì)粒。

（4）BamHⅠ和HinRⅢ兩種限制酶切割產(chǎn)生的黏性末端不同，若用這兩種限制酶同時(shí)處理外源DNA和質(zhì)粒，再用DNA連接酶連接兩者時(shí)，可避免切割的外源DNA、質(zhì)粒的粘性末端自身環(huán)化。

（5）構(gòu)建重組質(zhì)粒時(shí)，用DNA連接酶將目的基因與運(yùn)載體連接起來，同時(shí)也可能將目的基因或運(yùn)載體自我連接，所以連接的產(chǎn)物有目的基因自身相連的、運(yùn)載體自身相連的和目的基因與運(yùn)載體相連共三種情況。

（6）重組質(zhì)粒中抗生素抗性基因是標(biāo)記基因，用于（鑒別和）篩選含有目的基因的受體細(xì)胞。

（7）大腸桿菌喪失吸收蔗糖能力，導(dǎo)入蔗糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因后可恢復(fù)吸收蔗糖能力，所以在以蔗糖為唯一含碳營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的培養(yǎng)基中培養(yǎng)，可篩選出需要的表達(dá)成功的大腸桿菌。