Question

【題目】為研究野生型擬南芥抗鹽機(jī)理，研究人員利用T-DNA插入擬南芥基因組中，得突變體Y。

（1）種植野生型擬南芥，將地上部分浸入______菌懸浮液中以實(shí)現(xiàn)轉(zhuǎn)化，該菌的T-DNA上需帶有抗除草劑基因以便篩選。在適宜條件下培養(yǎng)，收獲種子（稱為T1代）。

（2）假設(shè)所處理植株為T-DNA單拷貝插入，則T1代植株自交后所結(jié)種子中具有抗除草劑性狀的占______。繼續(xù)種植具有抗除草劑性狀的種子，長成植株后進(jìn)行自交，若______，表明獲得了純合的轉(zhuǎn)基因突變體植株Y。

（3）野生型擬南芥的抗鹽性狀與D基因密切相關(guān)，T-DNA插入到D基因中，致使該基因失活，失活后的基因記為d。收集上述突變體Y葉片并提取DNA，分別用引物“LB+RP”組合及“LP+RP”組合進(jìn)行PCR擴(kuò)增。已知插入完整T-DNA后，“LP+RP”不能完成PCR擴(kuò)增如圖．檢測擴(kuò)增結(jié)果中，若______，則相應(yīng)植株的基因型為Dd；若______，則相應(yīng)植株的基因型為dd。

（4）研究人員收集7個突變體的葉片，提取葉片總mRNA，并逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，利用特異性引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，結(jié)果如圖．基因actin在擬南芥中表達(dá)相對穩(wěn)定，作為本實(shí)驗(yàn)的______，結(jié)果表明______號植株因T-DNA的插入，D基因完全沉默。

（5）將野生型和突變體種子消毒后，分別播種于含有不同濃度NaCl培養(yǎng)基中，觀察種子萌發(fā)情況，結(jié)果見如圖．

由如圖可知，在不含NaCl的培養(yǎng)基上，野生型和突變體種子的萌發(fā)率______；隨著NaCl濃度的升高，突變體種子的萌發(fā)率明顯______。

（6）野生型在高濃度NaCl脅迫下，脫落酸（ABA）含量增加，并迅速參與到抗脅迫的反應(yīng)中。突變體D基因由于T-DNA的插入不能正常表達(dá)，導(dǎo)致突變體的抗鹽性下降，由此推測D基因抗鹽作用的機(jī)理是______。

Answer 1

【答案】農(nóng)桿 3/4 全部具有抗除草劑性狀 “LB+RP”組合和“LP+RP”組合均能進(jìn)行PCR擴(kuò)增 “LB+RP”組合能擴(kuò)增，“LP+RP”組合不能擴(kuò)增 參照或標(biāo)準(zhǔn) 5 沒有明顯差異 下降 D基因的表達(dá)會促進(jìn)ABA的合成，從而提高抗鹽能力

【解析】

基因工程技術(shù)的基本步驟：（1）目的基因的獲�。悍椒ㄓ袕幕�因文庫中獲取、利用PCR技術(shù)擴(kuò)增和人工合成。（2）基因表達(dá)載體的構(gòu)建：是基因工程的核心步驟，基因表達(dá)載體包括目的基因、啟動子、終止子和標(biāo)記基因等。（3）將目的基因?qū)�入受體細(xì)胞：根據(jù)受體細(xì)胞不同，導(dǎo)入的方法也不一樣。將目的基因?qū)�入植物�?xì)胞的方法有農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法、基因槍法和花粉管通道法；將目的基因?qū)�入動物�?xì)胞最有效的方法是顯微注射法；將目的基因?qū)�入微生物�?xì)胞的方法是感受態(tài)細(xì)胞法。（4）目的基因的檢測與鑒定：分子水平上的檢測：①檢測轉(zhuǎn)基因生物染色體的DNA是否插入目的基因--DNA分子雜交技術(shù)；②檢測目的基因是否轉(zhuǎn)錄出了mRNA--分子雜交技術(shù)；③檢測目的基因是否翻譯成蛋白質(zhì)--抗原-抗體雜交技術(shù)。個體水平上的鑒定：抗蟲鑒定、抗病鑒定、活性鑒定等。

（1）研究人員利用T-DNA插入擬南芥基因組中，T-DNA是農(nóng)桿菌質(zhì)粒的組成，所以種植野生型擬南芥，將地上部分浸入農(nóng)桿菌懸浮液中以實(shí)現(xiàn)轉(zhuǎn)化，該菌的T-DNA上需帶有抗除草劑基因以便篩選。在適宜條件下培養(yǎng)，收獲種子。

（2）假設(shè)所處理植株為T-DNA單拷貝插入，則T1代植株基因型為雜合子，自交后所結(jié)種子中具有抗除草劑性狀的占3/4，繼續(xù)種植具有抗除草劑性狀的種子，長成植株后進(jìn)行自交，若全部具有抗除草劑性狀或沒有性狀分離，表明獲得了純合的轉(zhuǎn)基因突變體植株Y。

（3）已知T-DNA插入到D基因中，致使該基因失活，失活后的基因記為d，由圖示引物的位置可知，若檢測擴(kuò)增結(jié)果中，若“LB+RP”組合和“LP+RP”組合均能進(jìn)行PCR擴(kuò)增，則相應(yīng)植株的基因型為Dd；若“LB+RP”組合能擴(kuò)增，“LP+RP”組合不能擴(kuò)增，則相應(yīng)植株的基因型為dd。

（4）基因actin在擬南芥中表達(dá)相對穩(wěn)定，作為本實(shí)驗(yàn)的參照或標(biāo)準(zhǔn)，結(jié)果表明5號植株因T-DNA的插入，使其沒有表達(dá)出D基因的產(chǎn)物，即D基因完全沉默。

（5）由圖3可知，在不含NaCl的培養(yǎng)基上，野生型和突變體種子的萌發(fā)率沒有明顯差異；隨著NaCl濃度的升高，突變體種子的萌發(fā)率明顯下降。

（6）野生型在高濃度NaCl脅迫下，脫落酸（ABA）含量增加，并迅速參與到抗脅迫的反應(yīng)中。突變體D基因由于T-DNA的插入不能正常表達(dá)，導(dǎo)致突變體的抗鹽性下降，由此推測D基因抗鹽作用的機(jī)理是D基因的表達(dá)會促進(jìn)ABA的合成，從而提高抗鹽能力。