Question

【題目】蜘蛛絲是自然界中機(jī)械性能最好的天然蛋白纖維，其強(qiáng)度高于制作防彈衣的凱夫拉纖維，有廣泛的應(yīng)用前景。但如何大量獲取蜘蛛絲纖維的問題一直難以解決。2018年8月，中科院分子植物科學(xué)卓越創(chuàng)新中心利用基因工程技術(shù)成功的在家蠶絲腺和蠶繭中大量表達(dá)蜘蛛絲蛋白�；卮鹣铝袉栴}：

（1）構(gòu)建基因表達(dá)載體時(shí)（如圖所示），需要在目的基因前后兩端分別引入______________的酶切位點(diǎn)，該方法比用同一種酶進(jìn)行酶切的優(yōu)勢(shì)是___________________________（答出一點(diǎn)即可）。

（2）利用PCR技術(shù)擴(kuò)增蜘蛛絲基因前，需根據(jù)目的基因的核苷酸序列設(shè)計(jì)____種引物，進(jìn)行PCR時(shí)需加熱至90～95℃然后冷卻至55～60℃，此操作的目的是__________________。

（3）為能從蠶絲中提取蛛絲蛋白，基因表達(dá)載體中目的基因的首段必須含有使其僅能在蠶的絲腺細(xì)胞中特異性表達(dá)的_______。當(dāng)其與______識(shí)別和結(jié)合，才能驅(qū)動(dòng)轉(zhuǎn)錄過程，最終翻譯成功。

（4）在研究過程中，發(fā)現(xiàn)目的基因已經(jīng)插入到蠶絲腺細(xì)胞染色體的DNA上，蠶絲中卻未能提取到蜘蛛絲，請(qǐng)分析原因及檢測(cè)方法_________________。

（5）研究人員發(fā)現(xiàn)若將蛛絲蛋白31號(hào)位的色氨酸替換為酪氨酸，蛛絲韌性可提高50%，此成果所用到的工程技術(shù)為_____________________________________________。

Answer 1

【答案】Xba I和Sac I 防止目的基因自身環(huán)化、防止目的基因反向連接 2 使DNA解鏈，然后使引物結(jié)合到互補(bǔ)DNA鏈上 啟動(dòng)子 RNA聚合酶 蛛絲蛋白基因未能正常進(jìn)行轉(zhuǎn)錄可用分子雜交技術(shù)檢測(cè)，蛛絲蛋白未能進(jìn)行正常翻譯可用抗原抗體雜交技術(shù)檢測(cè) 蛋白質(zhì)工程

【解析】

在構(gòu)建基因表達(dá)載體時(shí)，可用一種或者多種限制酶進(jìn)行切割，為了避免目的基因和載體在酶切后產(chǎn)生的末端發(fā)生任意連接，一般選用兩種限制酶分別對(duì)目的基因、運(yùn)載體進(jìn)行切割。一個(gè)基因表達(dá)載體的組成，主要有目的基因、標(biāo)記基因、啟動(dòng)子和終止子，其中啟動(dòng)子位于基因首端，是RNA聚合酶識(shí)別和結(jié)合的位點(diǎn)，標(biāo)記基因的作用是為了鑒別受體細(xì)胞中是否含有目的基因，從而將含有目的基因的細(xì)胞篩選出來。據(jù)此根據(jù)題圖，HindⅢ在標(biāo)記基因中，故不能使用，只能選擇Xba I和Sac I兩種酶進(jìn)行切割。PCR技術(shù)擴(kuò)增DNA時(shí)，需要的條件有：目的基因、一對(duì)引物、四種脫氧核苷酸、熱穩(wěn)定DNA聚合酶等，反應(yīng)過程是變性（當(dāng)溫度上升到90℃以上時(shí)，雙鏈DNA解聚為單鏈）→復(fù)性（溫度下降到50℃左右，兩種引物通過堿基互補(bǔ)配對(duì)與兩條單鏈DNA結(jié)合）→延伸（72℃左右時(shí)，TaqDNA聚合酶有最大活性，可使DNA新鏈由5'端向3'端延伸）。檢測(cè)目的基因是否轉(zhuǎn)錄出了mRNA可用分子雜交技術(shù)；檢測(cè)目的基因是否翻譯成蛋白質(zhì)可用抗原-抗體雜交技術(shù)。

（1）據(jù)分析可知，構(gòu)建基因表達(dá)載體時(shí)需要在目的基因前后兩端分別引入Xba I和Sac I 的酶切位點(diǎn)，相比用同一種酶進(jìn)行酶切，用兩種酶切割可以防止目的基因自身環(huán)化或防止目的基因反向連接。

（2）利用PCR技術(shù)擴(kuò)增蜘蛛絲基因前，需根據(jù)目的基因的核苷酸序列設(shè)計(jì)2種引物；進(jìn)行PCR時(shí)需加熱至90～95℃然后冷卻至55～60℃，此操作的目的是使DNA解鏈，然后使引物結(jié)合到互補(bǔ)DNA鏈上。

（3）為能從蠶絲中提取蛛絲蛋白，基因表達(dá)載體中目的基因的首段必須含有使其僅能在蠶的絲腺細(xì)胞中特異性表達(dá)的啟動(dòng)子。當(dāng)其與RNA聚合酶識(shí)別和結(jié)合，才能驅(qū)動(dòng)轉(zhuǎn)錄過程，最終翻譯成功。

（4）在研究過程中，發(fā)現(xiàn)目的基因已經(jīng)插入到蠶絲腺細(xì)胞染色體的DNA上，蠶絲中卻未能提取到蜘蛛絲，推測(cè)有兩種可能，①是目的基因?qū)�入但沒有正常轉(zhuǎn)錄，若蛛絲蛋白基因未能正常進(jìn)行轉(zhuǎn)錄可用分子雜交技術(shù)檢測(cè)；②是目的基因轉(zhuǎn)錄后沒有翻譯產(chǎn)生蛋白質(zhì)，若蛛絲蛋白未能進(jìn)行正常翻譯可用抗原-抗體雜交技術(shù)檢測(cè)。

（5）研究人員發(fā)現(xiàn)若將蛛絲蛋白31號(hào)位的色氨酸替換為酪氨酸，蛛絲韌性可提高50%，此成果所用到的工程技術(shù)為蛋白質(zhì)工程。