Question

【題目】禾谷鐮刀菌可侵染小麥等作物，使其產(chǎn)量和品質(zhì)下降。研究者通過構(gòu)建融合基因 Ve-FG 并轉(zhuǎn)化擬南芥，以期實(shí)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因植物抗禾谷鐮刀菌的目的。

（1）利用 PCR 技術(shù)，將野生番茄的抗黃萎病基因 Ve 與禾谷鐮刀菌的識別基因 FG 進(jìn)行重組，構(gòu)建融合基因 Ve-FG（如圖 1）。

① 設(shè)計 3 對引物。其中引物 2 的一部分序列與 C 片段一部分序列互補(bǔ)，另一部分序列與_____片段一部分序列互補(bǔ)。

② 通過 PCR 分別克隆A、C、P 片段�？寺� A 片段應(yīng)選用的引物是_____。

③ 以 A、C、P 片段為_____進(jìn)行延伸，將 A、P、C 片段拼接，再以引物 1、4 進(jìn)行 PCR，擴(kuò)增融合基因 Ve-FG。

（2）用_____將 Ve-FG 與質(zhì)粒連接，構(gòu)建重組質(zhì)粒（如圖 2，圖中潮霉素抗性基因只在植物細(xì)胞中表達(dá)）。將農(nóng)桿菌與重組質(zhì)粒混合，一段時間后涂布到含有_____的平板培養(yǎng)基上進(jìn)行篩選。用含重組質(zhì)粒的農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化擬南芥，幾周后收獲種子，種在含有潮霉素的培養(yǎng)基上，獲得轉(zhuǎn)基因擬南芥株系 1 和株系 2。

（3）分別提取株系 1 和 2、非轉(zhuǎn)基因擬南芥植株葉片中的 DNA 作為模板，PCR 擴(kuò)增 Ve-FG 基因后進(jìn)行電泳，結(jié)果如圖 3。

① 電泳時應(yīng)以_____為陽性對照。

② 成功導(dǎo)入 Ve-FG 基因的是_____。

③ 株系 1 可抗潮霉素，但電泳結(jié)果無陽性條帶，原因可能是_____。

（4）為檢驗(yàn)融合基因 Ve-FG 的功能，以導(dǎo)入 Ve-FG 基因的植株為實(shí)驗(yàn)組，導(dǎo)入空白質(zhì)粒的植株為對照組，分別接種_____。一段時間后觀察發(fā)現(xiàn)，與對照植株相比，實(shí)驗(yàn)組整體長勢更旺盛，葉片萎蔫程度、葉片變黃程度也較輕，這表明_____。

Answer 1

【答案】P 1、3 模板 DNA連接酶 卡那霉素 融合基因 Ve-FG 株系 2 株系1中導(dǎo)入的是空白質(zhì)粒，應(yīng)空白質(zhì)粒中也含有上述的兩種抗性基因 禾谷鐮刀菌 轉(zhuǎn)基因擬南芥中的Ve-FG基因在擬南芥細(xì)胞中成功表達(dá)。

【解析】

PCR一般要經(jīng)歷三十多次循環(huán)，每次循環(huán)可分為變性、復(fù)性、延伸三步。在循環(huán)之前，常需要進(jìn)行一次預(yù)變性，以便增加大分子模板DNA徹底變性的概率。PCR過程為:變性，當(dāng)溫度上升到90 ℃以上時，氫鍵斷裂，雙鏈DNA解旋為單鏈。復(fù)性，當(dāng)溫度降低到50℃左右是，兩種引物通過堿基互補(bǔ)配對與兩條單鏈DNA結(jié)合。延伸，溫度上升到72 ℃左右，溶液中的四種脫氧核苷酸，在DNA聚合酶的作用下，根據(jù)堿基互補(bǔ)配對原則合成新的DNA鏈。

（1）① 設(shè)計 3 對引物。其中引物 2 的一部分序列與 C 片段一部分序列互補(bǔ)，另一部分序列與P片段一部分序列互補(bǔ)，才能實(shí)現(xiàn)圖示的連接。

② 通過 PCR 分別克隆A、C、P 片段。選用的引物1、3可完成A 片段的克隆。

③ 以 A、C、P 片段為模板進(jìn)行延伸，將 A、P、C 片段拼接，再以引物 1、4 進(jìn)行 PCR，擴(kuò)增融合基因 Ve-FG。

（2）用DNA連接酶將 Ve-FG 與質(zhì)粒連接，構(gòu)建重組質(zhì)粒（如圖 2）。將農(nóng)桿菌與重組質(zhì)�；旌�，由于 重組質(zhì)粒中含有抗卡那霉素的基因和潮霉素抗性基因，但是潮霉素抗性基因只在植物細(xì)胞中表達(dá)，因此，一段時間后將農(nóng)桿菌涂布到含有卡那霉素的平板培養(yǎng)基上進(jìn)行篩選，從而將經(jīng)過轉(zhuǎn)化的農(nóng)桿菌篩選出來。用含重組質(zhì)粒的農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化擬南芥，幾周后收獲種子，種在含有潮霉素的培養(yǎng)基上，從而將含有重組質(zhì)粒的擬南芥株系 1 和株系 2篩選出來。

（3）分別提取株系 1 和 2、非轉(zhuǎn)基因擬南芥植株葉片中的 DNA 作為模板，PCR 擴(kuò)增 Ve-FG 基因后進(jìn)行電泳，結(jié)果如圖 3。

① 電泳時應(yīng)以融合基因 Ve-FG為陽性對照。

② 成功導(dǎo)入 Ve-FG 基因的是株系2。

③ 株系 1 可抗潮霉素，但電泳結(jié)果無陽性條帶，原因可能是株系1導(dǎo)入的是空白質(zhì)粒，從而不能急檢測到目的基因。

（4）為檢驗(yàn)融合基因 Ve-FG 的功能，以導(dǎo)入 Ve-FG 基因的植株為實(shí)驗(yàn)組，導(dǎo)入空白質(zhì)粒的植株為對照組，分別接種禾谷鐮刀菌。一段時間后觀察發(fā)現(xiàn)，與對照植株相比，實(shí)驗(yàn)組整體長勢更旺盛，葉片萎蔫程度、葉片變黃程度也較輕，這表明導(dǎo)入的Ve-FG基因在擬南芥細(xì)胞中成功表達(dá)。