Question

【題目】圖甲為構建重組質粒過程中的三種備選質粒，其中Ap為氨芐青霉素抗性基因，Tc為四環(huán)素抗性基因。圖乙為培育轉AFPs基因(抗凍基因)番茄的示意圖，外源DNA和質粒上均標出了酶切位點及相關抗性基因，請回答下列問題。

(1)圖甲中通常選用質粒C構建重組質粒，而不選用質粒A或質粒B的原因分別是______________________。

(2)據圖乙分析，若需使用插入滅活法篩選并鑒定重組質粒，應優(yōu)先選用限制酶________切割目的基因和質粒。

(3)通過PCR技術獲取目的基因時需設計________種引物；從cDNA文庫中獲得的目的基因________(填“含有”或“不含有”)啟動子和終止子。

(4)在構建基因表達載體過程中常把兩個啟動子串聯在一起形成雙啟動子，加在目的基因上游。雙啟動子的作用可能是________。

(5)圖乙農桿菌中的質粒應含有T－DNA，其作用是________。若要獲得抗凍能力更強的抗凍番茄，可以對AFPs基因進行改造，最終得到相應的蛋白質，該過程需用到____________工程。

(6)為使改造后的AFPs基因能夠表達，人工設計質粒D并對它的多個酶切位點進行研究。若用HindⅢ酶或KpnⅠ酶單獨切割質粒D，均獲得一條長鏈，若用HindⅢ酶和EcoRⅠ酶同時切割，則獲得2個500bp和1個2666bp片段，若用KpnⅠ酶和EcoRⅠ酶同時切割，則獲得2個250bp和1個3166bp片段。若以HindⅢ酶切割位點為計算起點，則KpnⅠ酶切割位點與HindⅢ酶切割位點最短長度為________，EcoRⅠ酶的兩個切割位點與HindⅢ切割位點的最短距離為________。

Answer 1

【答案】質粒A中沒有標記基因，質粒B的復制原點中含有HindⅢ酶切位點 BamHⅠ和HindⅢ 2 不含有 保證目的基因的高效轉錄(高效表達) 攜帶目的基因進入番茄細胞并整合到番茄細胞的染色體DNA 蛋白質 750bp 500bp

【解析】

基因工程的操作步驟：目的基因的獲取、構建基因表達載體、把目的基因導入受體細胞、目的基因的檢測和鑒定。

（1）質粒A缺乏標記基因，質粒B的復制原點中含有限制酶切割位點，可能會破壞復制原點，質粒C含有多個標記基因和酶切位點，適宜作為基因工程的載體。

（2）圖乙中，選用的質粒C作為基因工程的載體，結合目的基因兩端的酶切位點，目的基因和載體可以選擇BamHⅠ和HindⅢ同時切割，或者EcoRⅠ和HindⅢ同時切割，若需使用插入滅活法篩選并鑒定重組質粒，應優(yōu)先選用限制酶BamHⅠ（會破壞Tc）和HindⅢ切割，可以根據是否對四環(huán)素有抗性來篩選。

（3）啟動子是RNA聚合酶結合的位點，是起始轉錄的位點，雙啟動子可能是為了高效轉錄。

（4）農桿菌轉化法中的Ti質粒含有的T-DNA可以攜帶目的基因進入番茄細胞并整合到番茄細胞的染色體DNA上。對AFPs基因進行改造，進而達到改造獲得抗凍能力更強的抗凍番茄，需要通過蛋白質工程實現。

（5）若用HindⅢ酶或KpnⅠ酶單獨切割質粒D，均獲得一條長鏈，說明該質粒上只含有HindⅢ酶的一個酶切位點和KpnⅠ酶的一個酶切位點；若用HindⅢ酶和EcoRⅠ酶同時切割，則獲得2個500bp和1個2666bp片段，若用KpnⅠ酶和EcoRⅠ酶同時切割，則獲得2個250bp和1個3166bp片段。說明EcoRⅠ酶有2個酶切位點，且兩個位點之間的最短距離是500bp，而KpnⅠ酶的切點在2個EcoRⅠ酶切點之間，距離每個EcoRⅠ酶切點250bp，HindⅢ酶切點距離最近的EcoRⅠ酶切點的最短距離是500bp，距離另一個EcoRⅠ酶切點的距離是500+500=1000 bp。故KpnⅠ酶切割位點與HindⅢ酶切割位點最短長度為250+500=750 bp，EcoRⅠ酶的兩個切割位點與HindⅢ切割位點的最短距離為500bp。