Question

【題目】下圖是某基因工程中構(gòu)建重組質(zhì)粒的過(guò)程示意圖，載體質(zhì)粒P0具有四環(huán)素抗性基因（tetr）和氨芐青霉素抗性基因（ampr）。請(qǐng)回答下列問(wèn)題：

（1）EcoRⅤ酶切位點(diǎn)為，EcoRⅤ酶切出來(lái)的線性載體P1為_______末端。

（2）用Taq DNA聚合酶進(jìn)行PCR擴(kuò)增獲得目的基因片段，其兩端各自帶有一個(gè)腺嘌呤脫氧核苷酸，載體P1用酶處理，在兩端各添加了一個(gè)堿基為_______的脫氧核苷酸，形成P2，P2和目的基因片段在_______酶作用下，形成重組質(zhì)粒P3。PCR技術(shù)中，使用的DNA聚合酶不同于一般生物體內(nèi)的DNA聚合酶，其最主要的特點(diǎn)是_____________________________________。

（3）PCR技術(shù)可以臨床用于診斷感染性疾病、腫瘤及遺傳病等，它是一種用于放大擴(kuò)增特定的DNA片段的分子生物學(xué)技術(shù)，其標(biāo)準(zhǔn)步驟為_______、退火、__________。

（4）重組質(zhì)粒中抗生素抗性基因的作用是為了___________________。若該目的基因是從cDNA文庫(kù)中分離獲取的蔗糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因，將重組質(zhì)粒導(dǎo)入喪失吸收蔗糖能力的大腸桿菌突變體中，然后在_______為唯一含碳營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的培養(yǎng)基中培養(yǎng)，以完成目的基因表達(dá)的初步檢測(cè)。

Answer 1

【答案】平 胸腺嘧啶（T） DNA 連接酶 耐高溫 變性 延伸 鑒別和篩選含目的基因的細(xì)胞 蔗糖

【解析】

1、基因表達(dá)載體的基本結(jié)構(gòu)包括復(fù)制原點(diǎn)、目的基因、標(biāo)記基因、啟動(dòng)子、終止子等。其中標(biāo)記基因的作用是為了鑒定受體細(xì)胞中是否含有目的基因，從而將含有目的基因的受體細(xì)胞篩選出來(lái)，常用的標(biāo)記基因是抗生素抗性基因。根據(jù)題干信息和圖形分析，P0是載體質(zhì)粒，其含有的氨芐青霉素抗性基因（ampr）和四環(huán)素抗性基因（tetr）都屬于標(biāo)記基因，可以用檢測(cè)目的基因是否導(dǎo)入受體細(xì)胞；EcoRV酶為限制酶，其切割質(zhì)粒后悔破壞了四環(huán)素抗性基因（tetr）。

2、PCR由變性--退火--延伸三個(gè)基本反應(yīng)步驟構(gòu)成：①模板DNA的變性：模板DNA經(jīng)加熱至94℃左右一定時(shí)間后，使模板DNA雙鏈或經(jīng)PCR擴(kuò)增形成的雙鏈DNA解離，使之成為單鏈，以便它與引物結(jié)合，為下輪反應(yīng)做準(zhǔn)備；

②模板DNA與引物的退火(復(fù)性)：模板DNA經(jīng)加熱變性成單鏈后，溫度降至55℃左右，引物與模板DNA單鏈的互補(bǔ)序列配對(duì)結(jié)合；

③引物的延伸：DNA模板--引物結(jié)合物在Taq酶的作用下，以dNTP為反應(yīng)原料，靶序列為模板，按堿基配對(duì)與半保留復(fù)制原理，合成一條新的與模板DNA 鏈互補(bǔ)的半保留復(fù)制鏈。

（1）根據(jù)題意分析，EcoRV酶識(shí)別的序列是-GATATC-，并且兩條鏈都在識(shí)別序列的堿基的中軸線T與A之間進(jìn)行切割，因此其切出來(lái)的線性載體P1為平末端。

（2）據(jù)圖分析，目的基因兩側(cè)為粘性末端，且漏出的堿基為A，則在載體P1的兩端需要個(gè)加一個(gè)胸腺嘧啶堿基T形成具有粘性末端的載體P2，再用DNA連接酶將P2與目的基因連接起來(lái)形成重組質(zhì)粒P3。由于在PCR擴(kuò)增技術(shù)中采用高溫使其變形解旋，因此需要使用的DNA聚合酶具有耐高溫的特點(diǎn)。

（3）根據(jù)以上分析可知，PCR技術(shù)的標(biāo)準(zhǔn)步驟包括變性、退火、延伸。

（4）根據(jù)以上分析可知，重組質(zhì)粒中抗生素抗性基因?qū)儆跇?biāo)記基因，其作用是鑒別和篩選含目的基因的細(xì)胞。根據(jù)題意可知，該目的基因是從cDNA文庫(kù)中分離獲取的蔗糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因，將重組質(zhì)粒導(dǎo)入喪失吸收蔗糖能力的大腸桿菌突變體中，在個(gè)體水平上鑒定目的基因是否表達(dá)，可以在以蔗糖為唯一碳源的培養(yǎng)基中培養(yǎng)大腸桿菌，如果大腸桿菌細(xì)胞內(nèi)目的基因表達(dá)出了蔗糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，該大腸桿菌能夠進(jìn)行正常的生長(zhǎng)和繁殖，則說(shuō)明目的基因完成了表達(dá)過(guò)程。