Question

【題目】為了增加油菜種子的含油量，研究人員嘗試將酶D基因與轉運肽基因相連，一起導入油菜細胞并獲得了轉基因油菜品種。

（1）研究人員依據基因的已知序列設計引物，采用__________法快速擴增從陸地棉基因文庫中獲取到的酶D基因和從擬南芥基因文庫中獲取到的轉運肽基因。所含三種限制酶（ClaⅠ、SacⅠ、XbaⅠ）的切點如圖所示，則用______酶和______酶處理兩個基因后，可得到_____端與_____端（填圖中字母）相連的融合基因。

（2）將上述融合基因插入如圖所示Ti質粒的T—DNA中，構建_________________________并導入農桿菌中。將獲得的農桿菌接種在含__________的固體平板上培養(yǎng)得到含融合基因的單菌落，再利用液體培養(yǎng)基振蕩培養(yǎng)，可以得到用于轉化的侵染液。

（3）剪取油菜的葉片放入侵染液中一段時間，此過程的目的是_______，進一步篩選后獲得轉基因油菜細胞，該細胞通過________技術，可培育成轉基因油菜植株。

（4）用________技術可檢測轉基因油菜植株中的融合基因是否成功表達。

Answer 1

【答案】PCR ClaⅠ DNA連接 A D 基因表達載體（或“重組質粒”） 四環(huán)素 利用農桿菌將融合基因導入油菜細胞 植物組織培養(yǎng) 抗原-抗體雜交

【解析】

基因工程的基本操作程序：

第一步：目的基因的獲取

1、原核基因采取直接分離獲得，真核基因是人工合成；

2、PCR技術擴增目的基因；

第二步：基因表達載體的構建

第三步：將目的基因導入受體細胞

將目的基因導入植物細胞：采用最多的方法是農桿菌轉化法，其次還有基因槍法和花粉管通道法等。

將目的基因導入動物細胞：最常用的方法是顯微注射技術；

將目的基因導入微生物細胞：用Ca2+處理。原核生物作為受體細胞的原因是繁殖快、多為單細胞、遺傳物質相對較少，最常用的原核細胞是大腸桿菌。

第四步：目的基因的檢測和表達。

（1）目的基因的擴增采用PCR技術；由于酶D基因和轉運肽基因都有ClaⅠ限制酶切位點，所以可以用ClaⅠ限制酶和DNA連接酶處理兩個基因后，得到A、D端相連的融合基因。

（2）將上述融合基因插入圖乙所示Ti質粒的T-DNA中，構建表達載體即重組質粒并導入農桿菌中。將獲得的農桿菌接種在含四環(huán)素的固體平板上培養(yǎng)得到單菌落，再利用液體培養(yǎng)基震蕩培養(yǎng)，可以得到用于轉化的浸染液。

（3）剪取油菜的葉片放入侵染液中一段時間，此過程的目的是利用農桿菌將融合基因導入油菜細胞，進一步篩選后獲得轉基因油菜細胞。該細胞通過植物組織培養(yǎng)技術，可培育成轉基因油菜植株。

（4）用抗原-抗體雜交法可檢測轉基因油菜植株中的融合基因是否成功表達。