Question

【題目】研究人員從血管內(nèi)皮瘤中發(fā)現(xiàn)了一種新的血管增生抑制劑一內(nèi)皮抑素，它能有效地抑制血管增生。下面是獲得重組內(nèi)皮抑素的方法，請(qǐng)分析回答下列問(wèn)題：

（1）從肝細(xì)胞中分離總RNA，經(jīng)____________獲得cDNA，之后經(jīng)過(guò)____________擴(kuò)增內(nèi)皮抑素基因。

（2）擴(kuò)增的目的基因與pUC18質(zhì)粒（如下圖所示）都用EcoRⅠ和BamHⅠ進(jìn)行雙酶切，然后用DNA連接酶進(jìn)行連接，構(gòu)建重組質(zhì)粒。雙酶切避免了目的基因與載體____________連接，還減少了____________的連接（答不全不給分），提高了重組質(zhì)粒的比例。

（3）大腸桿菌pUC18質(zhì)粒的lacZ基因中如果沒(méi)有插入外源基因，lacZ基因便可表達(dá)出β-半乳糖苷酶，當(dāng)培養(yǎng)基中含有IPTG和X-gal時(shí)，X-gal便會(huì)被β-半乳糖苷酶水解成藍(lán)色，大腸桿菌將形成藍(lán)色菌落。反之，則形成白色菌落。

選擇培養(yǎng)基中除含有大腸桿菌必需的葡萄糖、氮源、無(wú)機(jī)鹽、水、生長(zhǎng)因子等營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)外，還應(yīng)加入______物質(zhì)。成功導(dǎo)入重組質(zhì)粒的大腸桿菌在培養(yǎng)基中形成_________顏色的菌落，原因是__________________。之所以選擇大腸桿菌作為基因工程的受體菌，其突出的優(yōu)點(diǎn)是：________________________。（至少答出兩點(diǎn)）

（4）從選擇培養(yǎng)基中挑取所需的單個(gè)菌落接種于液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)，獲得粗提表達(dá)產(chǎn)物。將等量毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞接種于細(xì)胞培養(yǎng)板，37℃培養(yǎng)。將等量____________的粗提表達(dá)產(chǎn)物加進(jìn)培養(yǎng)孔中，72h后在顯微鏡下觀察細(xì)胞存活情況并________________________，實(shí)驗(yàn)結(jié)果如下表所示。

粗提表達(dá)產(chǎn)物濃度（μg/mL）	0	2	4	6	8	10
活的內(nèi)皮細(xì)胞數(shù)目（×lO2）	12	6	2	1	0.5	0.5

實(shí)驗(yàn)結(jié)果說(shuō)明________________________________________________。

Answer 1

【答案】 反轉(zhuǎn)錄（或逆轉(zhuǎn)錄） PCR DNA連接 目的基因與目的基因、載體與載體 IPTG、X—gal、氨芐青霉素 白 重組質(zhì)粒的lacZ基因中插入了目的基因，使lacZ基因不能表達(dá)出β-半乳糖苷酶 單細(xì)胞，繁殖快，代謝旺盛，遺傳物質(zhì)相對(duì)較少 不同濃度 活的內(nèi)皮細(xì)胞數(shù)目 重組內(nèi)皮抑素（或粗提表達(dá)產(chǎn)物）能夠抑制毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖

【解析】試題分析：此題考查了基因工程技術(shù)，目的基因的獲得方法有三種：從基因文庫(kù)中獲取、PCR技術(shù)擴(kuò)增、人工合成法。分析可知：基因表達(dá)載體中的LacZ基因會(huì)被外源基因插入滅活。

（1）從肝細(xì)胞中分離出相應(yīng)的RNA，經(jīng)反轉(zhuǎn)錄（或逆轉(zhuǎn)錄）獲得內(nèi)皮抑素基因，再利用PCR技術(shù)進(jìn)行體外擴(kuò)增，以獲得更多的目的基因。

（2）雙酶切后，目的基因兩端的黏性末端不同，被切開(kāi)的運(yùn)載體兩端的黏性末端也不同，這樣可以避免目的基因與載體反向連接，還能減少目的基因與目的基因、載體與載體的連接，還減少了目的基因和質(zhì)粒的自身連接，提高了重組質(zhì)粒的比例。

（3）大腸桿菌pUC18質(zhì)粒的LacZ基因中如果沒(méi)有插入外源基因，LacZ基因便可表達(dá)出β半乳糖苷酶，當(dāng)培養(yǎng)基中含有IPTG和Xgal時(shí)，Xgal便會(huì)被β半乳糖苷酶水解成藍(lán)色，大腸桿菌將形成藍(lán)色菌落，反之，則形成白色菌落。選擇培養(yǎng)基中除含有大腸桿菌必需的葡萄糖、氮源、無(wú)機(jī)鹽、水、生長(zhǎng)因子等營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)外，還應(yīng)加入的物質(zhì)有IPTG、X-gal和氨芐青霉素。因?yàn)橹亟M質(zhì)粒的LacZ基因中插入了目的基因，使LacZ基因不能表達(dá)出β-半乳糖苷酶，所以成功導(dǎo)入重組質(zhì)粒的大腸桿菌在培養(yǎng)基中形成白色菌落。基因工程中選擇大腸桿菌作為受體細(xì)胞的原因是大腸桿菌是單細(xì)胞生物，繁殖速度快，遺傳物質(zhì)相對(duì)較少。

（4）由表中數(shù)據(jù)可知，粗提表達(dá)產(chǎn)物濃度越高，活的內(nèi)皮細(xì)胞數(shù)目越少，說(shuō)明重組內(nèi)皮抑素（或粗提表達(dá)產(chǎn)物）能夠抑制毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖。