Question

【題目】下表是幾種限制酶識(shí)別序列及其切割位點(diǎn)，圖中甲、乙中標(biāo)注了相關(guān)限制酶的酶切位點(diǎn)，其中切割位點(diǎn)相同的不再重復(fù)標(biāo)注。請(qǐng)回答下列問(wèn)題。

限制酶	BamHⅠ	BclⅠ	Sau3AⅠ	HindⅢ
識(shí)別序 列及切割 位點(diǎn)	G↓GATCC CCTAG↑G	T↓GATCA ACTAG↑T	↓GATC CTAG↑	A↓AGCTT TTCGA↑A

(1)用圖中質(zhì)粒和目的基因構(gòu)建重組質(zhì)粒，應(yīng)選用限制酶為______，酶切后的載體和目的基因片段通過(guò)________酶作用后，獲得重組質(zhì)粒。

(2)若BclⅠ酶切的DNA末端與HindⅢ酶切的DNA末端可直接被DNA連接酶連接，原因是_______，這兩種酶_____________(填“都能” “都不能”或“只有一種能”)切開(kāi)連接的部位，原因是________________________。

(3)若用Sau3AⅠ切割圖甲質(zhì)粒最多可能獲得______種大小不同的DNA片段。
(4)為了篩選出轉(zhuǎn)入了重組質(zhì)粒的大腸桿菌，應(yīng)在篩選平板培養(yǎng)基中添加________平板上長(zhǎng)出的菌落，常用PCR鑒定，所用的引物組成為圖乙中的____________________________________。

Answer 1

【答案】BclⅠ和HindⅢ DNA連接 黏性末端相同 都不能 核苷酸序列不能再被BclⅠ和HindⅢ識(shí)別切割 7 四環(huán)素 引物A和引物C

【解析】

1、選擇限制酶需注意插入目的基因時(shí)不能破壞標(biāo)記基因。PCR擴(kuò)增基因時(shí)，兩種引物結(jié)合的部位相反，延伸的方向相反。限制酶具有特異性，不同的限制酶識(shí)別不同的序列，判斷某種限制酶能否切割該片段，應(yīng)該看該片段中是否含有限制酶的識(shí)別序列。

2、根據(jù)題意和圖示分析可知：在質(zhì)粒上存在BamH I、BclⅠ、 BamH I和HindⅢ等四個(gè)酶切位點(diǎn)，其中BamHI的切割位點(diǎn)在兩個(gè)抗性基因上都有，Ⅰ而抗性基因?yàn)檩d體的標(biāo)記基因，因此不可用該酶切割。在目的基因上，BclⅠ、BamH I、HindⅢ和 Sau3A I四種酶也存在酶切位點(diǎn)。

(1)若選BamHⅠ和HindⅢ切割，則會(huì)破壞質(zhì)粒中的兩個(gè)抗性基因，不利于后期的篩選。選擇的限制酶應(yīng)在目的基因兩側(cè)切割，切割后的DNA片段用DNA連接酶連接。

(2)BamHⅠ酶切的DNA末端與BclⅠ酶切的DNA末端可直接被DNA連接酶連接，原因是黏性末端相同，但是被DNA連接酶連接后便不能再被這兩種限制酶切割了，因?yàn)椴粷M足兩種限制酶對(duì)其所識(shí)別序列的特異性要求。

(3)Sau3AⅠ在圖甲質(zhì)粒中一共有3個(gè)切點(diǎn)，考慮完全酶切和不完全酶切，最多可能得到7種不同大小的DNA片段。

(4)為了篩選出轉(zhuǎn)入了重組質(zhì)粒的大腸桿菌，應(yīng)在篩選平板培養(yǎng)基中添加四環(huán)素(根據(jù)標(biāo)記基因的種類)，平板上長(zhǎng)出的菌落，常用PCR鑒定，所用的引物應(yīng)具有成對(duì)反向的特點(diǎn)。