Question

【題目】圖1是某基因工程中構(gòu)建重組質(zhì)粒的過程示意圖，載體質(zhì)粒P0具有四環(huán)素抗性基因（tetr)和氨芐青霉素抗性基因（ampr）。請回答下列問題：

（1）EcoRV酶切位點為，EcoR V酶切出來的線性載體P1為___________未端。

（2）用TaqDNA聚合酶進行PCR擴增獲得的目的基因片段，其兩端各自帶有一個腺嘌呤脫氧核苷酸。載體P1用酶處理，在兩端各添加了一個堿基為___________的脫氧核苷酸，形成P2；P2和目的基因片段在__________酶作用下，形成重組質(zhì)粒P3。

（3）為篩選出含有重組質(zhì)粒P3的菌落，采用含有不同抗生素的平板進行篩選，得到A、B、C三類菌落，其生長情況如下表（“+”代表生長，“﹣”代表不生長）。根據(jù)表中結(jié)果判斷，應(yīng)選擇的菌落是__________（填表中字母）類，另外兩類菌落質(zhì)粒導(dǎo)入情況分別是_____、________________。

菌落類型平板類型	A	B	C
無抗生素	﹢	﹢	﹢
氨芐青霉素	﹢	﹢	﹣
四環(huán)素	﹢	﹣	﹣
氨芐青霉素+四環(huán)素	﹢	﹣	﹣

（4）為鑒定篩選出的菌落中是否含有正確插入目的基因的重組質(zhì)粒，擬設(shè)計引物進行PCR鑒定。圖2所示為甲、乙、丙3條引物在正確重組質(zhì)粒中的相應(yīng)位置，PCR鑒定時應(yīng)選擇的一對引物是__________。某學(xué)生嘗試用圖中另外一對引物從某一菌落的質(zhì)粒中擴增出了400bp片段，原因是_______________。

Answer 1

【答案】平 胸腺嘧啶（T） DNA連接 B A類菌落含有P0 C類菌落未轉(zhuǎn)入質(zhì)粒 乙丙 目的基因反向連接

【解析】

基因表達載體的基本結(jié)構(gòu)包括復(fù)制原點、目的基因、標記基因、啟動子、終止子等。根據(jù)題干信息和圖形分析，P0是載體質(zhì)粒，其含有的氨芐青霉素抗性基因（ampr）和四環(huán)素抗性基因（tetr）都屬于標記基因，可以用檢測目的基因是否導(dǎo)入受體細胞；EcoRV酶為限制酶，其切割質(zhì)粒后悔破壞了四環(huán)素抗性基因（tetr）。

（1）根據(jù)題意分析，EcoRV酶識別的序列是-GATATC-，并且兩條鏈都在中間的T與A之間進行切割，因此其切出來的線性載體P1為平末端。

（2）據(jù)圖分析，目的基因兩側(cè)為粘性末端，且漏出的堿基為A，則在載體P1的兩端需要個加一個堿基T形成具有粘性末端的載體P2，再用DNA連接酶將P2與目的基因連接起來形成重組質(zhì)粒P3。

（3）根據(jù)以上分析已知，限制酶切割后破壞了四環(huán)素抗性基因，但是沒有破壞氨芐青霉素抗性基因，因此含有重組質(zhì)粒P3的菌落在四環(huán)素中應(yīng)該不能生長，而在氨芐青霉素的培養(yǎng)基中能生長，結(jié)合表格分析可知，應(yīng)該選擇B類菌落。根據(jù)表格分析，A類菌落在氨芐青霉素和四環(huán)素的培養(yǎng)基中都能夠生長，說明其導(dǎo)入的是P0；C類菌落在任何抗生素的培養(yǎng)基中都不能生長，說明其沒有導(dǎo)入任何質(zhì)粒。

（4）據(jù)圖分析，根據(jù)目的基因插入的位置和PCR技術(shù)的原理分析，PCR鑒定時應(yīng)該選擇的一對引物是乙和丙；根據(jù)題意和圖形分析，某同學(xué)用圖中的另外一對引物（甲、乙）從某一菌落的質(zhì)粒中擴增出了400bp的片段，說明其目的基因發(fā)生了反向連接。